如何解决倒置荧光显微镜使用常见问题？

倒置荧光显微镜是细胞培养、细胞转染和很多生物研究中常用的仪器，相比共聚焦显微镜，倒置荧光显微镜的成像精度虽然稍低，但仪器更普及，更容易买到或者约到，而且使用维护都更简单点。今天我们就给大家分享下倒置荧光显微镜使用可能遇到的常见问题，以及可能的解决办法。

·什么是倒置荧光显微镜

倒置荧光显微镜MF52-CF

倒置荧光显微镜由倒置显微镜和落射荧光模块组成，倒置显微镜是相对正置显微镜的概念，其物镜、照明系统相对样品的位置是颠倒的；落射荧光模块是荧光观察的核心部件，有转盘式荧光模块和集成荧光模块两种，转盘式后期可升级，但需要独立的荧光光源灯箱，用转盘式模块的倒置荧光显微镜更大、更重、更贵。

·为什么要用倒置荧光显微镜

倒置荧光显微镜通常最高只会配40X物镜，因此放大倍率、分辨率不如正置荧光显微镜，但胜在应用层面更方便好用。

倒置荧光显微镜观察多孔板

首先倒置荧光显微镜的物镜有更长工具距离，可以适配各种培养皿从底部直接成像，从而节省了反复制样做玻片的麻烦，效率更高更适合大批量、多视野培养细胞等样品的观察。

倒置荧光显微镜观察无沾染观察

另一点优势是倒置荧光显微镜可以无沾染观察，无沾染意思是因为观察无需打开培养皿，可避免取样制样带来的沾染污染风险。

倒置荧光显微MF53-N搭配显微操作系统

最后一个倒置荧光显微镜的优势是更大的工作空间，因为倒置荧光显微的明场照明系统采用的是长工作距离聚光镜，因此载物台上方有更大空间，更方便安装使用显微操作系统等配件。

·怎么使用倒置荧光显微镜

倒置荧光显微镜相衬和荧光叠加成像

倒置荧光显微镜通常可以实现明场、相衬和荧光观察，如果仪器附近有贴SOP或者说明书，可以看看，快速上手。明场观察很简单，可以看病理切片等样品，这里不赘述；相衬观察需要切换到相衬物镜，然后把上光源光强调高，聚光镜光阑调到PHP位置（最大位置），切换相衬环板到对应的位置即可；难点是荧光观察，不同倒置荧光显微镜有不同结构，大致可以分为研究级倒置荧光显微镜和新型倒置荧光显微镜两种，我们分别以MF53-N和MF52-N为例进行说明。

研究级倒置荧光显微镜MF53-N

MF53-N是研究级倒置荧光显微镜的代表，它采用转盘式荧光模块，可以按需选择不同的荧光激发块，背面带荧光灯箱接口，可以使用大功率宽光谱LED荧光光源MG-100、四通道光源MG-120或者汞灯等作为荧光光源。

这种倒置荧光显微镜会有独立的光源控制器，首先关闭明场光源，通过控制器打开荧光光源，调节光强，然后转盘选择荧光通道，放样品，操作对焦，再切换分光拉杆到相机成像拍照。不同荧光通道需要分别调节光强并拍照，如果是MG-100或者MG-120，光源可以即开即用，亮度可自由调节，比较方便，而汞灯使用需要预热、亮度只能靠ND减光镜控制，操作更复杂，也更容易出各种问题。

倒置荧光显微镜MF52-N

MF52-N是新型倒置荧光显微镜的代表，它采用高度集成的数显LED荧光模块，不需要外接荧光灯箱和控制器，能直接在模块上控制荧光开关、光强设置和通道切换等操作，并提供数据化光强显示，可以配备3个荧光通道，满足BGU等常见的荧光观察需要，更易于使用。

新型倒置荧光显微镜结构比研究级简单，首先关闭明场光源，打开模块上的光源开关，然后拉杆切换荧光通道并调节光强，放样品，后续操作和研究级一样就行。奥林巴斯CKX41、CKX53都可以通过明美的倒置荧光模块升级成类似的新型倒置荧光显微镜。

升级荧光观察的DMIL

另外，尼康TS100、徕卡DMIL这两款无限远光学倒置，也能通过我们的荧光模块和荧光光源升级成倒置荧光显微镜，但它们都是外挂荧光光源搭配推拉切换荧光通道的设计，用起来比一般的新型倒置荧光显微镜复杂些。

·怎么拍出好的荧光图片？

高灵敏度相机成像更好

这是很多实验操作人员非常关心的问题，首先要说明的一点是，倒置荧光显微镜的光路结构比正置荧光显微镜复杂，光损更大，因此荧光拍照难度比正置高，需要比较高灵敏度的相机，比如MSX11、MC50-S等，尤其一些采用了固定分光设计的倒置荧光显微镜。

半复消色差物镜效果更好

第二个点是选择合适的物镜，落射荧光观察中激发光和发射光都需要经过物镜一趟，物镜荧光通过率低的话会导致光损非常大，一般的相衬物镜、带厚度适配环的物镜都有较大光损，可以的话应该选择半复消色差的相衬物镜/普通物镜，它们上面会有SAPO（Semi-APO）、PL FL、Fluor之类标记，如果有APO标记的复消色差的物镜更好，如果没有半复消色差用Plan标记的平场消色差的物镜也还能凑合。

多色荧光需要分别微调对焦

第三个点是对焦，不同荧光通道的波长不同，焦面会有一定的偏移，因此不同荧光通道需要分别微调对焦才能获得更锐利的成像，明美显微数码测量分析系统软件界面下方的清晰度状态数据可以为对焦提供参考。如果您是半复消色差的相衬物镜，还能先在相衬下对好焦，再切换到荧光拍照，减少淬灭的可能性。

·可能遇到哪些常见问题？

倒置荧光显微镜结构比共聚焦简单，出问题的机率更低，但并不是不会出问题，好消息是很多问题可能简单处理一下也能排除。

荧光模块没转到位会挡住激发光

常见问题1：完全没有激发光。从光源开始检查光路，光源接好并打开了吗？荧光切换机构是否旋转到位/拉杆切换到位了？是否有错位的ND滤镜？是否Shutter关上了？如果整个光路都正常，可能就是光源坏了，对于汞灯就是换灯泡，LED荧光光源可能换个通道还能用，因为不同荧光通道对应的是不同的LED灯珠/灯珠阵列。

分光拉杆没拉到位会没有成像

常见问题2：有激发光但没成像。先观察分光栏杆，分光栏杆没到位的话目镜和相机都会没有成像，目镜通常很好确认有无荧光，除非是CY5之类肉眼看不见的近红外波长。目镜有成像，相机看不到就要调整曝光时间和曝光增益，如果近期升级过系统可能还有驱动失效之类问题。如果最终成像细节较差、容易过曝，基本就是相机灵敏度太低的问题，除了升级相机没有什么好方法解决。

乱动灯箱上的旋钮会导致荧光不均匀

常见问题3：有成像但有异常瑕疵，就要看情况。比如荧光不均匀，可能是荧光灯箱调错了聚光位置；有强荧光背景，可能是上聚光镜反光了，上聚光镜有挡板的用挡板，无挡板的收小光阑也可能有用；FITC和TRITC完全重叠、有信号但预期目标没染出来，可能不是仪器问题，是出现了交叉反应，需要重新检查染色流程是不是做错了。

·倒置荧光显微镜能不能用高倍油浸物镜？

一般来说倒置荧光显微镜配备的物镜最高只有40X，因为倒置荧光显微镜的上聚光镜NA数值孔径不到0.6，无法匹配60X/100X等高数值孔径物镜。但如果只看荧光观察的话，其实倒置荧光显微镜是可以搭配100X油浸物镜使用的，需要注意的是，100X物镜是为0.17厚度的盖玻片校正的，因此需要使用0.17厚度的共聚焦培养皿或者反转放置的细胞爬片。

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